
Proteiinipalvelut

Proteiinipalvelu tarjoaa proteiinien ekspressiota, puhdistusta ja karakterisointia. Proteiinit tuotetaan bakteeri-, hyönteis- ja nisäkkäsoluissa, jotka tarjoavat laajan valikoiman ekspressio- ja muokkausmahdollisuuksia erilaisiin biologisiin kokeisiin.
Johdanto
Proteinipalvelu (PS eli Protein Service) tarjoaa rekombinanttiproteiinien ekspressiota, puhdistusta ja biokemiallista karakterisointia lääkekehitykseen ja elämäntieteiden tutkimukseen. Proteiineja voidaan käyttää rakenteellisessa biologiassa, proteiini-ligandi- ja proteiini-proteiini-vuorovaikutustutkim uksissa sekä diagnostiikan kehittämisessä.
Palvelu tarjoaa neuvontaa proteiinien ekspressiomenetelmistä ja ekspressiovektoreista, mutta asiakas on yleensä itse vastuussa ekspressiovektorin valmistamisesta. Proteiinipalvelu voi tilata kiinnostuksen kohteena olevat synteettiset geenit asiakkaan puolesta. Tyypillinen työnkulku sisältää pilottitutkimuksen proteiinituotannosta ja puhdistuksesta pienellä tilavuudella, sitten mittakaavan laajentamisen litratasolle, proteiinin eristämisen ja puhdistamisen sekä lopuksi proteiinin karakterisoinnin erilaisilla biokemiallisilla ja biokemiallisilla menetelmillä, mukaan lukien vuorovaikutustutkimukset.
Huomautus: Proteinipalvelu pystyy käsittelemään vain biosuojaluokan 1 tuotteita
Tilauslomake
Proteinipalvelun tilauslomake sisältää:
- Tutkimussopimus - Liiketoimintaoperaatiot (Tampereen yliopisto)
- Yleiset ehdot - Liiketoimintaoperaatiot (Tampereen yliopisto)
Proteiinien ekspressiopalvelu
Kolme ekspressiojärjestelmää (bakteeri-, hyönteis- ja nisäkkässolut) on tällä hetkellä saatavilla ja ne tarjoavat mahdollisuuksia monenlaisille erityyppisille proteiineille. Mahdollista asiakasta pyydetään ottamaan yhteyttä proteiinipalveluyksikön koordinaattoriin saadakseen lisätietoja, mikäli sopivan ekspressiojärjestelmän valinta ei ole selvää.
Proteiinien ekspressio E. colissa
Asiakas toimittaa ekspressiovektorin, ja ekspressio varmistetaan ensin käyttäen pullo- tai kuoppalevyviljelyjä (mikä mahdollistaa myös kasvatusliuoksen optimoinnin). Positiivisten tulosten jälkeen tuotanto voidaan aloittaa käyttäen pulloja ravistimissa tai pienikokoisessa fermentorissa.
Bioreaktorilaboratorio tarjoaa proteiinituotantoa bakteeripohjaisessa isännässä 4,5 litran erissä käyttäen Labfors Infors 3 -fermentoria. Tarkasti ohjatut kasvuolosuhteet mahdollistavat suuremman solutiheyden ja paremman tuotteen laadun verrattuna perinteisiin pulloviljelyihin.
PS lähettää lopulliset tuotteet asiakkaalle ja raportoi SDS-PAGE- ja Western Blot -tulokset (asiakasta pyydetään toimittamaan vasta-aineet WB:tä varten, mikäli tavallinen vasta-aine ei ole saatavilla).
Bakulovirus-ekspressiovektori (BEVS)
Asiakas toimittaa halutun insertin plasmidivektorissa ja asiakasta pyydetään vahvistamaan klooni DNA-sekvensoinnilla. Tarvittaessa DNA-sekvensointi voidaan tehdä myös Tampereen yliopistossa.
Huomio! PS pyytää mittaamaan ja merkitsemään toimitetun plasmidin pitoisuuden (vähintään 5 ng, V=25 µl).
Donoriplasmidia käytetään valmistamaan kolme tai kuusi bakmidia, jotka varmistetaan PCR:llä, minkä jälkeen kolme niistä transfektoidaan Sf9-hyönteissoluihin (tarvittaessa HighFiveTM-solut). Sekundaarisen viruksen (P2) tilavuus on tyypillisesti 50 ml, ja proteiinin ekspressio varmistetaan Western Blotilla solupelletistä ja viljelynesteestä (vasta-aineet mahdollista puhdistus-tagia vastaan tai asiakkaan toimittamina). Virus varastoidaan kuukaudeksi ja sitä voidaan käyttää ekspression optimointiin tai mahdolliseen tuotannon laajentamiseen enintään 4,5 litraan 500 ml:n annoksina. Lisäksi proteiinipuhdistus His-tagilla tai Strept-tagilla on myös mahdollista.
Nisäkässolulinja transfektiota, ekspressiota ja suuren mittakaavan rekombinanttiproteiinituotantoa varten
Asiakas toimittaa halutun cDNA:n sopivassa plasmidivektorissa ja asiakasta pyydetään vahvistamaan klooni sekvensoinnilla. Tarvittaessa DNA-sekvensointi voidaan tehdä myös Tampereen yliopistossa.
Ekspressiovektori transfektoidaan nisäkässoluihin (CHO-S tai HEK 293F) ennen neljän viikon pituista solulinjan valintaa. Pilottikokeen ekspressiosta tehdään SDS-PAGE ja Western blot, joilla varmistetaan halutun proteiinin ekspressio. Solulinjat säilytetään neljä kuukautta käytettäväksi jatkotuotantoon. Päätös mittakaavan laajentamisesta pyydetään antamaan kuukauden sisään. Laajennuksessa solut sopeutetaan ensin suspensiokasvuun, ja proteiinin ekspressio varmennetaan SDS-PAGE:lla ja Western blotilla 50 ml:n näytteestä. Tämä vaihe kestää noin kaksi viikkoa, jonka jälkeen laajennus 5 litraan on mahdollista.
Proteiinin eristys, puhdistus ja karakterisointi
Isäntäsolut kerätään sentrifugoinnilla ja lysoidaan käyttäen joko tehokasta sonikaattoria tai korkeapaineista homogenisaattoria (Emulsiflex). Proteiinin eristys ja puhdistus tehdään yleensä kromatografisilla menetelmillä. Proteiinin laadun arviointi voidaan tehdä useilla menetelmillä, mukaan lukien analyyttinen geelisuodatus, SDS-PAGE, 2-D-elektroforeesi, dynaaminen valonsironta, kalorimetriset menetelmät ja biosensorit. Proteiinien kiteytyspalvelua on myös saatavilla. Proteiinit voidaan toimittaa joko liuoksena tai jäädytettynä.
Laitteet-välilehden alla on lyhyt yhteenveto käytettävissä olevista menetelmistä ja laitteista.
KIITOKSET
Kaikkien Proteiini (PS) -palvelun käyttäjien on velvollisuus mainita palvelu ja Biocenter Finland julkaisuissaan:
“The authors acknowledge the Biocenter Finland and Tampere facility of Protein Services (PS) for their service.”
tai "Kirjoittajat kiittävät Biokeskus Suomea (Biocenter Finland) ja Proteiini (PS) -palvelun Tampereen toimipistettä heidän palvelustaan."

Biocenter Finland (Biokeskus Suomi) tukee osittain palvelua.